Ressourcen für die Forschung

Robuste, validierte Zell-, Krankheits- und Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung, um die Forschung und Entwicklung von Medikamenten gegen Mukoviszidose (CF) zu beschleunigen. Ein Mangel an Modellsystemen zur Unterstützung der Untersuchung von CFTR-Mutationen bisher ein Hindernis für den Fortschritt darstellte. Bei Emily's Entourage engagieren wir uns sehr für die Investition in und die Entwicklung von streng getesteten Modellsystemen und Forschungsressourcen für Menschen mit Mukoviszidose, die nicht von den aktuellen CFTR-Modulatoren profitieren. 

Der Forschungsgemeinschaft stehen unter anderem folgende Ressourcen zur Verfügung:

Komplementäre DNA-Konstrukte

cDNA-Konstrukte, die mutiertes (W1282X-CFTR) und durch die W1282X-CFTR-Mutation abgeschnittenes CFTR exprimieren (CFTR₁₂₈₁) sind verfügbar. Die Konstrukte wurden in pcDNA3.1/Zeo(+) erzeugt und können leicht in andere Vektoren subkloniert werden. Weitere Informationen sind verfügbar hier. Die Herstellung dieser cDNA-Konstrukte wurde von Emily's Entourage unterstützt. 

Virale Konstrukte

Lentivirale und adenovirale Konstrukte, die für Anti-Codon-Engineering-Transfer-RNAs (ACE-tRNAs) kodieren, die CFTR-Genotypen mit vorzeitigen Terminationscodons (PTCs), einschließlich W1282X, erkennen und effizient unterdrücken, wurden von John Lueck, PhD, University of Rochester Medical Center, entwickelt. Weitere Informationen sind verfügbar hier. Die Herstellung dieser viralen Konstrukte wurde von Emily's Entourage unterstützt.

Zellmodelle

Epithelzellen der Atemwege

• Ein Panel von Epithelzellen der Atemwege wurde von Finn J. Hawkins, MBBCh, Boston University, unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus pwCF mit W1282X-CFTR (und weiteren CFTR-Mutationen) erzeugt. Diese Zellen können in Kultur gehalten, zu pseudostratifiziertem Epithel in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für elektrophysiologische Untersuchungen differenziert und kryokonserviert werden. Dies ist ein wertvolles Forschungsinstrument zur Untersuchung von Mukoviszidose und zur Beschleunigung der therapeutischen Entwicklung für Mukoviszidose, die durch seltene Varianten verursacht wird. Die Entwicklung dieser Zellgruppe wurde von Emily's Entourage unterstützt. Wenn Sie wissen möchten, welcher Genotyp verfügbar ist, und wenn Sie MTA-Anfragen stellen möchten, wenden Sie sich bitte an Dr. Finn J. Hawkins.

Entwickelte HEK293T-Zellen 

• Humane embryonale Nierenzellen (HEK) 293T, die 3HA-tagged W1282X-CFTR (und weitere CFTR-Mutationen) exprimieren, sind bei Marianne Carlon, PhD, KU Leuven, erhältlich. Diese Zelllinien sind ein hervorragendes Forschungsinstrument für das schnelle Screening zahlreicher CFTR-Korrekturstrategien (z. B. Wirkstoffe, Genaddition und Gen-Editierung). Sie lassen sich leicht transfizieren, und der 3HA-Tag ermöglicht ein einfaches Ablesen der Proteinebene (z. B. durch Western Blot und Immunzytochemie zur Lokalisierung der Plasmamembran). Die Herstellung dieser gentechnisch veränderten Zelllinien wurde im Open-Access-Format veröffentlicht (Bulcaen et al., Cell Reports Medicine, 2024) und wurde von Emily's Entourage unterstützt. Wenn Sie wissen möchten, welche Genotypen verfügbar sind, und wenn Sie MTA-Anfragen stellen möchten, wenden Sie sich bitte an Dr. Marianne Carlon.
• Ein zuvor beschriebener Prime-Editing-Reporter (PEAR; Simon et al., eLife, 2022) wurde von Marianne Carlon, PhD, KU Leuven, für die Kompatibilität mit der Produktion lentiviraler Partikel angepasst. Es wurde eine stabile Zelllinie (PEAR-Zelllinie) erzeugt, die den GFP-Reporter mit unterbrochener Spleißstelle in Kombination mit konstitutiver Expression von miRFP kodiert. Nach erfolgreichem Prime- oder Adenin-Basen-Editing wird die PEAR-HEK293T-Zelllinie GFP-positiv, was die Untersuchung neuer PE- oder ABE-VLP-Architekturen, die Optimierung von Produktionsprotokollen und die funktionelle Titration neuer Präparate ermöglicht. Die Herstellung dieser stabilen Zelllinie wurde von Emily's Entourage unterstützt. Für MTA-Anfragen wenden Sie sich bitte an Dr. Marianne Carlon.

Schilddrüsenepithelzellmodelle der Ratte

• Zellmodelle der Fischer-Ratten-Schilddrüse (FRT), die W1282X-CFTR und CFTR exprimieren₁₂₈₁ (mit dem halidempfindlichen Reporter EYFP-H148Q/I152L/F46L). Diese Zellmodelle eignen sich für die fluoreszenz- und elektrophysiologische Bewertung der CFTR-Aktivität. Weitere Informationen sind verfügbar hier. Die Herstellung dieser Zellmodelle wurde von Emily's Entourage unterstützt.

Modelle immortalisierter Epithelzellen der Atemwege  

• Immortalisierte CFBE41o-Atemwegsepithelzellen, die W1282X-CFTR oder CFTR exprimieren₁₂₈₁ mit konstruierten Triplett-HA-Epitop-Tags zur Erleichterung der Biochemie und Zelloberflächenpräsentation wurden von Gergerly Lukacs, MD, PhD, McGill University, entwickelt. 

Gen-editierte Modelle von Epithelzellen der Atemwege

• Gen-editierte immortalisierte 16HBE14o-Human-Bronchial-Epithelzellen, die W1282X-CFTR (und weitere CFTR-Mutationen) exprimieren, wurden vom Therapeutik-Labor der Cystic Fibrosis Foundation hergestellt und sind erhältlich hier.
  
• Die gentechnisch veränderten 16HBE14o-Zellen, die W1282X-CFTR (und weitere CFTR-Mutationen) exprimieren und vom CFFT-Labor erzeugt wurden, wurden von Marianne Carlon, PhD, KU Leuven, so verändert, dass sie ein halid-sensitives (HS) gelbes Fluoreszenzprotein (YFP) exprimieren. Durch die stabile Expression von HS-YFP in diesen Zellen kann die funktionelle CFTR-Korrektur überwacht werden. Dies kann ein wertvolles Forschungsinstrument sein, um die Wirksamkeit von Gene Editing oder anderen Korrekturstrategien zu untersuchen. Die Entwicklung dieser Zellmodelle wurde von Emily's Entourage unterstützt. Wenn Sie wissen möchten, welcher Genotyp verfügbar ist, und wenn Sie MTA-Anfragen stellen möchten, wenden Sie sich bitte an Dr. Marianne Carlon.

Wachstumsverbesserte Modelle von Epithelzellen der Atemwege

• Nahezu native, wachstumsfördernde homozygote W1282X-CFTR-Nasenepithelzellen, die ein Proto-Onkogen (Bmi-1) und die katalytische Untereinheit der Telomerase (hTERT) exprimieren, sind von Scott Randell, PhD, University of North Carolina, Chapel Hill, erhältlich. Weitere Informationen sind erhältlich hier. Die Herstellung dieser Zellmodelle wurde von Emily's Entourage unterstützt. 

Humane primäre Epithelzellen der Atemwege und intestinale Organoide

• Primäre Nasen-, Lungen- und Darmzellen mit zwei Nonsense-Mutationen (einschließlich homozygoter W1282X/W1282X-Zellen) sind aus der RARE-Zellsammlung der CFF im Labor der Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT) verfügbar. Die Zellen werden auf der Grundlage der Verfügbarkeit und der Bewertung eines kurzen (ca. halbseitigen) Forschungsplans verteilt, der auf seine wissenschaftliche Eignung geprüft wird. Wenn Sie wissen möchten, welcher Genotyp verfügbar ist, wenden Sie sich bitte an Jessica Stach. MTA-Anträge können über das CFFT-Labor gestellt werden hier.

Humane primäre Nasenepithelzellen und Stammzellmodelle

• Eine Biobank mit nasalen Epithelzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die von Menschen mit Mukoviszidose isoliert wurden, einschließlich derjenigen, die homozygot oder heterozygot für die Mutationen W1282X und/oder G542X sind, ist beim CF Canada-SickKids Program in Individual Therapy (CFIT). Bestimmte iPSCs wurden CrispR-editiert, um isogene Kontrollen zu erzeugen.

Rektale Organoide

• Rektale Organoide, die von homozygoten W1282X-CFTR-Personen stammen, werden von der folgenden Organisation gepflegt und sind bei ihr erhältlich Hubrecht Organoid Technologie und die Mukoviszidose-Stiftung Therapeutisches Labor.
• Von Patienten abgeleitete Darmorganoide (PDIOS), die ACE-tRNAs stabil exprimieren, wurden von Jeffrey M. Beekman, PhD, UMC Utrecht, mittels lentiviraler Transduktion entwickelt. Die Entwicklung dieser Zelllinien wird spezifischen Experimenten wie qPCRs, Western-Blots und Toxizitätsassays zugute kommen. Weitere Informationen sind verfügbar hier. Emily's Entourage unterstützte die Erzeugung von stabilen PDIOS-exprimierenden ACE-tRNAs.

Stammzellen-Modell

• Induzierte pluripotente Stammzellen, die homozygot für die W1282X-CFTR-Mutation sind, sind erhältlich bei der Diamant-Labor, Universität von Pennsylvania. 

Auf maschinellem Lernen basierende Algorithmen

• Ein auf maschinellem Lernen basierender Algorithmus namens DETECTOR für die Analyse von CF-Organoiden wurde von Marianne Carlon, PhD, KU Leuven, entwickelt und beschrieben hier (Bulcaen et al., Cell Reports Medicine, 2024). DETECTOR ist ein Werkzeug zur schnellen Prüfung und Analyse von Gen-Editing-Therapieansätzen in Darmorganoiden. Obwohl dieses Tool explizit für die Arbeit mit Gene Editing in Organoiden entwickelt wurde, kann es problemlos auf die Genaddition oder jede andere Strategie angewendet werden, die zu einer funktionellen CFTR-Korrektur führt. Die Entwicklung dieses Organoid-Tools wurde von Emily's Entourage unterstützt und ist frei verfügbar über GitHub.

Murine Modelle

• Mausmodelle zur Untersuchung der Pathologie der zystischen Fibrose (CF), einschließlich Modellen der durch Nonsense-Mutationen verursachten CF, sind bei Craig Hodges, PhD, am Case Western Reserve University Zystische Fibrose Mausmodell Kern.

Nanopartikel

Lipid-Nanopartikel

• Neuartige Lipid-Nanopartikel, die RNA (mRNA und sgRNA) einkapseln, wurden im Labor von Debadyuti (Rana) Ghosh, PhD, The University of Texas at Austin entwickelt. Die Entwicklung dieser Formulierung wurde von Emily's Entourage unterstützt. Die Zusammensetzung und die Methoden zur Formulierung stehen auch anderen Forschungsgruppen zur Verfügung, um therapeutische RNA-Fracht zu liefern. Wenn Sie MTA-Anfragen stellen möchten, wenden Sie sich bitte an Dr. Ghosh.
  

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